Tiorredoxinas plastidiales: sobreexpresión y aplicaciones biotecnológicas.

Se describe la secuencia genética de la tiorredoxina f (Trx) cloroplástica de la especie N. tabacum, su método de clonación, expresión en plastidios y aplicaciones. Se proporcionan además los vectores de coexpresión plastidial que contienen moléculas de ADN que codifican Trx f, los hospedadores que los incorporan, especialmente E. coli y, particularmente, plantas transgénicas obtenidas con tales vectores, así como su método de obtención y su aplicación en la sobreexpresión de Trx en forma soluble y activa en dichas plantas y en la producción incrementada de almidón y sacarosa.

Los citados vectores plastidiales se aplican además a la producción plastidial incrementada de proteínas heterólogas recombinantes, coexpresadas con las secuencias de Trx f, concretamente albúmina sérica (HSA) y cardiotrofina-1 (hCT1) humanas. Se describen también métodos de obtención de proteínas heterólogas coexpresadas con Trx f, biológicamente activas y en conformación nativa; así como la obtención de hCT1 recombinante en forma soluble y con bioactividad incrementada.

Tiorredoxinas plastidiales: sobreexpresión y aplicaciones biotecnológicas.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere al campo de la Biotecnología, y específicamente a vectores plastidiales específicos que incorporan la secuencia genética de la tiorredoxina f (Trx) cloroplástica de la especie N. tabacum, su método de clonación, expresión en plastidios y aplicaciones. La invención proporciona además los hospedadores que incorporan dichos vectores y, particularmente, plantas transgénicas obtenidas con tales vectores, así como su método de obtención y su aplicación a la sobreexpresión de Trx f en forma soluble y activa en dichas plantas y a la producción incrementada de almidón y sacarosa.

La invención se aplica además a la producción plastidial incrementada de proteínas heterólogas recombinantes, coexpresadas con las secuencias de Trx, concretamente albúmina sérica (HSA) y cardiotrofina-1 (hCT1) humanas. Se describen también métodos de obtención de proteínas heterólogas coexpresadas con Trx, biológicamente activas y en conformación nativa; así como la obtención de proteínas recombinantes en forma soluble y con bioactividad incrementada.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Las tiorredoxinas son pequeñas proteínas termoestables (12 kDa) presentes en todos los organismos que catalizan intercambios tiol-disulfuro y regulan el ambiente redox de la célula, controlando un amplio rango de procesos bioquímicos. Esta regulación depende, en la mayoría de los casos, de la capacidad de las tiorredoxinas de reducir puentes disulfuro de proteínas diana. En plantas, el sistema tiorredoxina es particularmente complejo, ya que existen múltiples isoformas y múltiples genes que codifican para cada tipo de tiorredoxina; siendo todos estos genes codificados nuclearmente, independientemente de su localización subcelular.

La multiplicidad de isoformas de tiorredoxinas encontradas en cloroplastos de Arabidopsis thaliana, cuatro isoformas de tiorredoxina m, dos f, una x, y dos y hace que surjan dudas respecto a la especificidad y las funciones de las mismas. Las tiorredoxinas más estudiadas hasta la fecha han sido las tiorredoxinas m y f, por ser las únicas asociadas a la regulación dependiente de la luz del metabolismo del carbono, a través del ciclo de las pentosas fosfato y del ciclo C4.

Las tiorredoxinas cloroplásticas se denominaron m y f en función de la enzima que son capaces de activar, la NADP-malato deshidrogenasa (NADP-MDH) y la fructosa-1, 6-bis-fosfatasa (FBPasa) respectivamente. Estudios filogenéticos y comparaciones estructurales han demostrado que las tiorredoxinas m tienen un origen procariota, están codificadas nuclearmente y se encuentran asociadas débilmente a las membranas externas del tilacoide. Las tiorredoxinas f están también codificadas nuclearmente y tienen un origen eucariota.

Las tiorredoxinas cloroplásticas pueden regular procesos tan importantes como: el ciclo de Calvin; el ciclo C4; el metabolismo del nitrógeno y del azufre; la biosíntesis de ácidos grasos, isoprenoides, tetrapirroles y vitaminas; la traducción; el ciclo de las pentosas fosfato; el estrés oxidativo; el ensamblaje/plegado de proteínas y degradación de las mismas; la degradación del almidón; la glicólisis; la división plastidial y la replicación del DNA. Recientemente se ha descrito la existencia de un completo sistema ferredoxina/tiorredoxina también en amiloplastos, regulando la actividad de enzimas implicadas en procesos tales como el metabolismo del almidón; la biosíntesis de lípidos, aminoácidos y nucleótidos; el plegado de proteínas y otras reacciones varias.

A pesar de la existencia de múltiples estudios sobre la estructura de las tiorredoxinas cloroplásticas, sus funciones y su regulación en la planta, es difícil conocer qué tiorredoxina actúa en cada proceso in vivo, debido a la pérdida de especificidad de las tiorredoxinas m y f mutadas usadas en proteómica y cromatografía de afinidad.

Transformación plastidial La información genética de las plantas se encuentra distribuida en tres compartimentos celulares: el núcleo, las mitocondrias y los plastidios. El genoma plastidial (plastoma) es circular de doble hélice, y en plantas superiores difiere en tamaño según la especie entre 120 y 160 kb. El número de copias del plastoma en el plastidio es variable, dependiendo del tipo de plastidio y del tipo de célula, pudiendo llegar a contener hasta 10.000 copias en una célula del mesófilo de la hoja.

En el proceso de transformación plastidial, la integración del ADN en el genoma plastidial se produce por recombinación homóloga. Se han probado hasta 14 lugares distintos de inserción en los que no ha habido efectos negativos, si bien los más utilizados han sido la región intergénica del trnI-trnA y la del rrn16/trnV-rps7/12. El método más utilizado para insertar los vectores en el ADN plastidial ha sido el bombardeo con helio a alta presión (método biolístico) . Para detectar la regeneración de transformantes se suelen utilizar marcadores de selección. El más eficiente hasta el momento ha sido el gen aadA de bacterias, que codifica la enzima 3’-adenilil-transferasa, y es capaz de inactivar antibióticos tipo aminoglicósidos, como la espectinomicina y la estreptomicina.

ES 2 384 777 Al Para lograr grandes niveles de acumulación de proteína recombinante, los transgenes se expresan bajo promotores constitutivos fuertes que aseguran altos niveles de ARNm. También se suelen incluir regiones 5’UTR que promuevan una traducción activa y estabilicen los transgenes. La elección de estos elementos resulta crucial para determinar las cantidades finales de acumulación de proteína, pues el inicio de la traducción es el paso limitante. En cambio, la región 3’UTR es importante para estabilizar el ARNm y no parece influir en el nivel de expresión de los transgenes.

La transformación plastidial presenta una serie de ventajas, incluida la capacidad de obtener elevados niveles de expresión de la proteína recombinante, pudiendo llegar a alcanzar hasta el 46% de la proteína soluble total, debido probablemente al elevado número de copias del transgén en la célula. Otras ventajas destacables son: la ausencia de “efecto posición”, permitiendo una expresión uniforme y reproducible del gen; la baja probabilidad en el flujo de transgenes a otros cultivos o especies salvajes relacionadas, ya que en la mayoría de las especies cultivadas los plastomas son heredados por vía materna; y la capacidad de procesamiento policistrónico, que los capacita para procesar varios transgenes bajo el control de un único promotor.

Las aplicaciones biotecnológicas de la transformación plastidial son amplias (Bock et al, 2001, Trends Biotech. 22, 311-318; Maliga, 2004, Annu. Rev. Plant. Biol. 55, 289-313) . Por una parte, han sido numerosos los estudios para dotar de ventajas agronómicas a los cultivos, como resistencia a insectos o a herbicidas y fitorremediación. También se ha publicado la expresión de moléculas de interés industrial como la xilanasa, trehalosa o el PHB. En una revisión (Heifetz, 2000, Biochim. 82, 655-666) , se recogen además otros trabajos de expresión plastidial que ya han sido patentados (E5 celulasa, aprotinina bovina y tolerancia a herbicidas norflorazon y bromoxynil) . La aplicación más extendida ha sido la producción de compuestos biofarmacéuticos en plastidios, probablemente porque las expectativas de mercado son altas y pueden esperarse grandes beneficios (Bock, 2007 Curr. Opin. Biotechnol. 18, 100-106; Daniell, 2006, Biotech. J. 1, 1071-1079) .

Sobreexpresión de Trx recombinantes en plantas Existen muy pocos trabajos en los que se han sobreexpresado tiorredoxinas en plantas. Cho et al (Cho et al, 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 14641-14646) sobreexpresaron una tiorredoxina h de trigo en el endospermo de cebada transgénica, obteniendo un incremento de hasta 4 veces en la actividad de la ‘starchdebranching enzyme’, enzima que rompe de manera específica los enlaces alfa-1, 6 en el almidón, en el endospermo de granos transgénicos germinados. También se ha visto que se aceleraba la emergencia de la radícula durante el proceso de germinación (Wong et al, 2002, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 16325-16330) . Asimismo, se ha descrito que la sobreexpresión de tiorredoxina h en cereales (trigo y cebada) puede utilizarse para mejorar la calidad harino-panadera del trigo, aumentando la fuerza de la masa (Joudrier et al, 2005, Biotech. Adv. 23, 81-85) y para mitigar la respuesta alergénica a las... [Seguir leyendo]

1. Vector de coexpresión plastidial derivado de un plásmido que comprende un fragmento de ADN que codifica tiorredoxina f o su precursor seleccionado del grupo formado por: SEQ ID Nº:1 y codón de inicio ATG unido a SEQ ID Nº:3, unido operativamente al promotor Prrn y a la secuencia del sitio de unión al ribosoma (RBS) de la región líder del gen 10 del bacteriófago T7 (G10L) ; y una secuencia que codifica una proteína heteróloga, unida operativamente al promotor psbA de Nicotiana tabacum.

2. Vector según la reivindicación 1 derivado del plásmido pAF, en el que la proteína heteróloga codificada es la albúmina sérica humana (HSA) , unida operativamente al promotor psbA de Nicotiana tabacum, que es el plásmido representado como pAFpsbAHSA::PrrnG10L TRXf.

3. Vector según la reivindicación 1 derivado del plásmido pL3, en el que la proteína heteróloga codificada es la cardiotrofina-1 humana (hCT1) , que es el plásmido representado como pL3PrrnG10LTRXf::psbAhCT1 .

4. Un organismo hospedador transformado con un vector plastidial según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3.

5. Organismo hospedador según la reivindicación 4, que consiste en una planta transgénica, sus semillas o material de propagación, caracterizada por que su genoma plastidial lleva integrada la secuencia comprendida entre las secuencias de recombinación homóloga de los vectores según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3.

6. Planta transgénica según la reivindicación 5, cuyo genoma plastidial lleva integrada la secuencia comprendida entre las secuencias de recombinación homóloga del vector de la reivindicación 2.

7. Planta transgénica según la reivindicación 5, cuyo genoma plastidial lleva integrado la secuencia comprendida entre las secuencias de recombinación homóloga del vector de la reivindicación 3.

8. Planta transgénica según una cualquiera de las reivindicaciones 5-7, perteneciente a las especies Nicotiana tabacum o Solanum tuberosum.

9. Método de obtención de las plantas transgénicas de las reivindicaciones 5-8, que comprende la integración de un vector de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, por cualquier medio apropiado, en el plastoma de una planta.

10. Método según la reivindicación 11, que comprende las siguientes etapas:

a) bombardeo de hojas cultivadas in vitro con una pistola de genes cargada con el vector de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3;

b) obtención de los primeros transformantes regenerados en medio de cultivo suplementado con un antibiótico frente al cual confiera resistencia el vector bombardeado;

c) realización de, al menos, un segundo ciclo de regeneración en medio selectivo con el mismo antibiótico, para obtener plantas homoplásmicas;

d) selección de las plantas homoplásmicas mediante cualquier método de selección de ADN por tamaños.

11. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 9-10, en el que, las hojas proceden de las especies Nicotiana tabacum o Solanum tuberosum y el antibiótico utilizado es espectinomicina.

12. Uso de una planta transgénica transformada con un vector de expresión plastidial recombinante que comprende: un fragmento de ácido nucleico que codifica un polipéptido seleccionado del grupo formado por: precursor de tiorredoxina f, tiorredoxina f madura; y, adicionalmente, secuencias de recombinación homóloga que permiten dirigir la inserción en el genoma plastidial de los fragmentos comprendidos entre ellas, un promotor constitutivo endógeno plastidial y una secuencia inductora de la traducción; seleccionándose dicho vector del grupo formado por el plásmido pL3psbATRXf y el plásmido pL3PrrnG10LTRXf, para aumentar las cantidades de almidón y sacarosa acumuladas en la planta, siendo dichas cantidades hasta 10 veces superiores a las acumuladas en los mismos tejidos u órganos de las plantas silvestres correspondientes, cultivadas en condiciones idénticas.

13. Uso de la planta transgénica descrita en la reivindicación 8, para la producción de proteína cardiotrofina-1 humana recombinante de bioactividad incrementada en al menos el doble respecto a la proteína cardiotrofina-1 humana expresada sola en cloroplastos.

14. Composición farmacéutica que comprende la proteína recombinante obtenida a partir de la planta transgénica descrita en la reivindicación 8, junto con un adjuvante y/o un vehículo farmacéuticamente aceptable.

15. Procedimiento para sobreexpresar proteínas heterólogas en forma soluble y activa, que comprende las siguientes etapas:

ES 2 384 777 Al a) obtener el vector de coexpresión plastidial descrito en una cualquiera de las reivindicaciones 1-3; b) transformar un organismo hospedador bacteriano o una planta con el vector de la etapa a) .

16. Procedimiento según la reivindicación 15 para sobreexpresar HSA, en el que: a) el vector de coexpresión es el descrito en la reivindicación 2; y b) el organismo hospedador es la planta transgénica descrita en la reivindicación 6.

17. Procedimiento según la reivindicación 15 para sobreexpresar hCT1, en el que:

a) el vector de coexpresión es el descrito en la reivindicación 3; y 10 b) el organismo hospedador es la planta transgénica descrita en la reivindicación 7.

18. Método de producción de proteínas heterólogas biológicamente activas y/o en su conformación nativa, que comprende:

a) cultivar las plantas transgénicas descritas en las reivindicaciones 5-8, en condiciones apropiadas para su crecimiento;

b) separar las partes verdes de la planta;

c) purificar la proteína heteróloga utilizando técnicas de cromatografía de afinidad, de separación por tamaños con un patrón o de intercambio iónico.

19. Método según la reivindicación 18 para producir albúmina sérica humana recombinante en forma soluble y conformación nativa, en el que la planta transgénica de la etapa a) es la descrita en la reivindicación 6.

ES 2 384 777 Al

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> UNIVERSIDAD PÚBLICA DE NAVARRA-CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTÍFICAS

<120> Tiorredoxinas plastidiales: sobreexpresión y aplicacionesbiotecnológicas <130> P-100710

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 528

<212> DNA

<213> Nicotiana tabacum

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (528)

<223> ADN codificante de proteína precursora de Trx f

<220>

<221> Péptido de tránsito

<222> (1) .. (165)

<223> ADN codificante de péptido de tránsito <400> 1 atg gcg ttg caa gtg caa gta aac ggc gta tcc ttg aag cct tca acg 48 Met Ala Leu Gln Val Gln Val Asn Gly Val Ser Leu Lys Pro Ser Thr1 5 10 15

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<210> 3

<211> 363

<212> DNA

<213> Nicotiana tabacum

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (363)

<223> ADN codificante de proteína Trx f madura <400> 3 agc tcc gat gct act gct act acc agt gtg acg gta ggg cag gtg act 48 Ser Ser Asp Ala Thr Ala Thr Thr Ser Val Thr Val Gly Gln Val Thr1 5 10 15

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<210> 4

<211> 120

<212> PRT

<213> Nicotiana tabacum

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<210> 5

<211> 513

<212> DNA

<213> Nicotiana tabacum

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (513)

<223> ADN codificante de proteína precursora de Trx m

<220>

<221> Péptido de tránsito

<222> (1) .. (174)

<223> ADN codificante de péptido de tránsito

<400> 5 cct tcg gca ctg ccg tcg tcg tca ctg gct ccg gta gcc ggt tct tcc 48 Pro Ser Ala Leu Pro Ser Ser Ser Leu Ala Pro Val Ala Gly Ser Ser1 5 10 15

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<210> 8

<211> 112

<212> PRT

<213> Nicotiana tabacum

<400> 8

Glu Ala Gln Asn Thr Ala Leu Glu Val Gly Ala Val Asn Asp Lys Thr1 5 10 15

Trp Lys Ser Leu Val Val Glu Ser Asp Ile Pro Val Leu Val Glu Phe20 25 30

Trp Ala Pro Trp Cys Gly Pro Cys Arg Met Ile His Pro Val Ile Asp35 40 45

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