Composiciones para diagnosis y terapia de enfermedades asociadas con la expresión aberrante de futrinas (R-Espondinas).

Uso de una molécula nucleotídica que codifica un polipéptido de Futrina 2 de acuerdo con SEC ID Nº:

27 para lapreparación de una composición farmacéutica para activación de la cascada de señales Wnt.

Composiciones para diagnosis y terapia de enfermedades asociadas con la expresión aberrante de futrinas (R-Espondinas)

La presente invención se refiere a composiciones útiles para la terapia de enfermedades asociadas con la expresión aberrante de los genes que codifican las proteínas Futrina 2 (=R-Espondina 3) . Estas enfermedades incluyen tumores de v.g. mama, ovario, hígado, útero, cérvix, colon, pulmón, ovario, recto, testículo, páncreas, huesos y piel, así como enfermedades que implican músculo, hueso, metabolismo de lípidos y glucosa, y obesidad. La presente invención se refiere también a un método para identificar activadores/agonistas o inhibidores/antagonistas de Futrina 2.

La cascada de señales Wnr juega un papel crucial en lo que respecta a la regulación de la supervivencia, proliferación y diferenciación de las células durante la embriogénesis, y el adulto como se muestra, v.g., en Drosophila, Xenopus y ratones (Nusse y Varmus, Cell 69 (1992) , 1073-1087) . Los genes Wnt codifican glicoproteínas secretoras que activan una cascada de señales bien caracterizada por la vía de un receptor Wnt denominado "frizzled" (ensortijado) .

La cascada de señalización Wnt y sus componentes juegan también un papel importante en diversas enfermedades, lo que hace deseable modular su actividad:

i) Cáncer

La tumorigénesis representa un proceso multietápico complejo en el cual se cree que cambios genéticos y factores ambientales desregulan los procesos celulares que controlan la proliferación y diferenciación de las células. Varios estudios indican que una cascada de señales Wnt aberrante está implicada en el desarrollo de cáncer de colon, cáncer de mama y melanoma (Pfeifer, Science, 275 (1997) , 1752-1753; Polakis, Genes Dev. 14 (2000) , 1837-1851) . El primer gen codificante de una proteína de la cascada de señales Wnt, int-1, fue aislado del virus del tumor mamario del ratón (MMTV) y pudo demostrarse que se trata de un oncogén. Por consiguiente, está bien establecido que una regulación aberrante de la actividad Wnt y/o componentes de la cascada de señales Wnt aguas abajo de la señal Wnt, v.g., beta-catenina y APC, están implicadas en la tumorigénesis.

ii) Enfermedad ósea Las señales Wnt promueven la formación de hueso (v.g. Yang, Development, 130 (2003) , 1003-15; Fischer,

J. Biol. Chem. 277 (2002) 30870-30878) . Coherentemente con esta idea, una mutación de aumento de función del receptor Wnt LRP5 causa enfermedad grave de los huesos (Boy den, et al., 346 (2002) N Engl J Med, 1513-21.; Little, et al, 70 (2002) Am J Hum Genet, 11-9.) . Inversamente, la desactivación de las mutaciones en LRP5 conduce a un síndrome de osteoporosis-pseudoglioma en humanos (Kato, et al., 157 (2002) J Cell Biol, 303-14.; Gong, et al., 107 (2001) Cell, 513-23.) .

iii) Enfermedad oftálmica La desactivación de la mutación en el receptor Wnt LRP5 conduce a pseudoglioma en humanos y malformaciones de los ojos en los ratones (Kato, et al, 157 (2002) J Cell Biol 303-314; Gong, et al, 107 (2001) Cell, 513-523) .

iv) Riñón La señalización aberrante Wnt está implicada en la fibrosis renal (Surendran, Am J Physiol Renal Physiol 282 (2002) 431-441) y la enfermedad de riñon poliquístico (Saadi-Kheddouci, Oncogene 20 (2001) 59725981) .

v) Metabolismo de lípidos y glucosa, obesidad

La deficiencia del receptor Wnt LRP5 en los ratones conduce a niveles incrementados de colesterol en plasma en ratones alimentados con una dieta rica en grasa, debido al aclaramiento hepático reducido de los residuos de quilomicrones. Adicionalmente, cuando se alimentan con una dieta normal, los ratones deficientes en LRP5 exhiben una tolerancia notablemente empeorada a la glucosa (Fujino, et al., 100 (2003) Proc Natl. Acad. Sci. USA, 229-234) . La administración del antagonista de LRP5 Dkkl a los ratones reduce la absorción de glucosa en diversas líneas de células y disminuye la deposición de grasa (WO 02/066509) .

Está claro por consiguiente, partiendo de lo anterior, que el camino de señalización Wnt está implicado en una diversidad de enfermedades humanas. Sin embargo, están insuficientemente disponibles medios para la terapia o diagnosis de las enfermedades asociadas con una cascada de señales Wnt desregulada. Por ello, el uso de marcadores moleculares fiables de diagnóstico sería útil para una comprensión de la base molecular de las enfermedades asociadas con una cascada de señales Wnt aberrante. Puede esperarse que tales marcadores sean también útiles para terapia y para el desarrollo de nuevas vías terapéuticas para tratamiento de las enfermedades dependientes de la cascada de señales Wnt, como se ha detallado arriba.

Así pues, el problema técnico que subyace en la presente invención es proporcionar medios para la terapia de enfermedades asociadas con una cascada de señalización Wnt aberrante.

La solución a dicho problema técnico se obtiene por la provisión de las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones.

Durante los experimentos que condujeron a la presente invención, pudo identificarse el gen 2, cuyo producto es un modulador del camino Wnt. Futrina 2 se identificó previamente como HPWTSR (Chen et al., 29 (2002) , Mol. Biol. Rep. 287-292) , una proteína de papel o función anteriormente desconocido, expresada en numerosos tipos de células. Adicionalmente, las Futrinas humanas 1, 2, 3 y 4 fueron descritas como Polipéptidos Semejantes a Factores del Crecimiento de las Células Madre, que son capaces de promover la proliferación de células madre hematopoyéticas (WO-A-01/77169; WO-A-01/07611) .

En lo que sigue se demuestra por primera vez: 1) las Futrinas intensifican la señalización Wnt y esto tiene relevancia fisiológica, dado que la inhibición de Futrina 1 ó 2 da como resultado la inhibición de la cascada de señales Wnt (señalización Wnt/β-catenina) . Estos datos demuestran que las Futrinas pueden considerarse como moduladores Wnt. La Futrina 1 (Rspo2) es co-expresada con y regulada positivamente por las señales Wnt y tiene efectos sinérgicos con Wnt para activar β-catenina. El análisis de la interacción funcional con los componentes del camino Wnt/β-catenina sugiere que Rspo2 funciona extracelularmente al nivel de la interacción receptor-ligando. Experimentos con morfolino antisentido en embriones de Xenopus y experimentos de RNAi en células HeLa revelaron que Rspo2 es necesaria para la señalización Wnt/β-catenina. En embriones de Xenopus empobrecidos en Rspo2, los marcadores musculares myoD y myf5 no pueden activarse y el desarrollo muscular posterior resulta deteriorado. Los resultados indican que Rspo2 es un nuevo activador de la cascada Wnt/β-catenina. Así, Futrinas tales como Rspo2 (Futrina 1) son útiles para la diagnosis y el desarrollo de terapias para enfermedades mediadas por Wnt-LRP, con inclusión de la supresión de tumores, formación de hueso, metabolismo de colesterol y glucosa (incluida diabetes) , obesidad, enfermedad renal y enfermedad oftálmica. 2.) Dado que los datos obtenidos demuestran que se requiere Futrina 1 para la formación de músculo, Futrina 1 es útil para la diagnosis y el desarrollo de terapias para enfermedades relacionadas con los músculos, con inclusión de la regeneración muscular. 3.) Los datos demuestran que las Futrinas se expresan aberrantemente en una diversidad de tumores humanos. Así pues, las Futrinas son útiles para la diagnosis de tumores y el desarrollo de terapias del cáncer. Por ejemplo, se ha encontrado que en la mayoría de los tumores, la expresión de Futrinas 1-3 está reducida drásticamente (tumores de colon, estómago, pulmón, recto para Futrina 1, tumores de mama, ovario, vejiga, útero, cérvix, recto para Futrina 2, tumores de útero y cérvix para Futrina 3) . En un pequeño número de casos, la expresión de Futrinas 1-3 está regulada en sentido creciente (un caso de tumor de estómago para Futrinas 1 y 2, tumor de ovario para Futrina 3) . Futrina 4 exhibe un nivel muy bajo de expresión en la mayoría de los tejidos estudiados, excepto en el ovario.

Así pues, la inhibición de la cascada de señales Wnt por inhibición de la expresión/actividad de las Futrinas o por estimulación de la expresión/actividad de las Futrinas tendrá un efecto terapéutico. Análogamente, la activación de la cascada de señales Wnt por disminución de la expresión de Futrina y/o por represión de la actividad del polipéptido propiamente dicho tendrá un efecto terapéutico.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Figura 1: Identificación de Futrina 1 (Rspo2) de Xenopus El informador TOP-FLASH, el DNA vector de agrupaciones de 250 clones cada una y pCSfrizzled8 se cotransfectaron. Se llevaron a cabo ensayos... [Seguir leyendo]

1. Uso de una molécula nucleotídica que codifica un polipéptido de Futrina 2 de acuerdo con SEC ID Nº: 27 para la preparación de una composición farmacéutica para activación de la cascada de señales Wnt.

2. Uso de un ligando que se fija específicamente a un polipéptido de Futrina 2 de acuerdo con SEC ID Nº: 27 para la preparación de una composición farmacéutica para inhibir la cascada de señales Wnt, en donde el ligando es un anticuerpo.

3. Uso de un ligando que se fija específicamente a un ácido nucleico que codifica un polipéptido de Futrina 2 de acuerdo con SEC ID Nº: 27 para la preparación de una composición farmacéutica para inhibir la cascada de señales Wnt, en donde el ligando es una molécula de nucleótido que se fija a un ácido nucleico de Futrina 2 que codifica un polipéptido de Futrina 2 de acuerdo con SEC ID Nº: 27.

4. Uso de acuerdo con la reivindicación 2, en donde el ligando es un anticuerpo monoclonal.

5. Uso de acuerdo con la reivindicación 4, en donde el anticuerpo es un anticuerpo quimérico, de cadena sencilla y/o humanizado.

6. Uso de acuerdo con la reivindicación 1 para soportar procesos regenerativos.

7. Uso de acuerdo con la reivindicación 1 para promover el crecimiento de músculo.

8. Uso de acuerdo con la reivindicación 2 ó 3 para uso en el tratamiento de tumores.

9. Uso de acuerdo con la reivindicación 8, para uso en el tratamiento de tumores de mama, ovario, hígado, cérvix, colon, pulmón, recto, testículos, páncreas, hueso y piel.

10. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, 2 ó 3, para modular la formación de hueso.

11. Un método para identificar activadores/agonistas o inhibidores/antagonistas de un polipéptido de Futrina 2 de acuerdo con SEC ID Nº: 27 o un polipéptido que muestra una identidad de al menos 80% con el mismo, que comprende los pasos de:

(a) incubar un compuesto candidato con dicho polipéptido;

(b) ensayar la actividad biológica de Futrina 2 de acuerdo con SEC ID Nº: 27 o un polipéptido que muestra una identidad de al menos 80% con el mismo, en un ensayo de informadores de luciferasa inducibles por Wnt en células HEK 293 transfectadas, y

(c) determinar si se ha alterado la actividad biológica de dicho polipéptido.

12. Un método para identificar y obtener un fármaco candidato para la terapia de una enfermedad asociada con actividades aberrantes de Futrina 2 de acuerdo con SEC ID Nº: 27 o un polipéptido que muestra una identidad de al menos 80% con el mismo, que comprende los pasos de:

(a) poner en contacto un polipéptido de Futrina 2 de acuerdo con SEC ID Nº: 27 o un polipéptido que muestra una identidad de al menos 80% con el mismo o una célula que expresa dicho polipéptido, y opcionalmente el o los ligandos correspondientes, en presencia de componentes capaces de proporcionar una señal detectable en respuesta a la fijación a dicho fármaco candidato a cribar; y

(b) detectar la presencia o ausencia de una señal o el aumento de la señal generada, en donde la presencia o aumento de la señal es indicativa de un fármaco supuesto.

en donde la actividad de Futrina 2 de acuerdo con SEC ID Nº 27 o un polipéptido que muestra una identidad de al menos 80% con el mismo es analizado por un ensayo de informadores de luciferasa indubles por Wnt en células HEK 293 transfectadas.

13. El método de acuerdo con la reivindicación 12, en el que el fármaco candidato es un solo compuesto o una pluralidad de compuestos.

14. El método de acuerdo con las reivindicaciones 12-13, en el que el compuesto se sintetiza químicamente, se produce por microbiología y/o está comprendido en extractos de células 45 15. El método de acuerdo con la reivindicación 11, en el que los activadores/agonistas o inhibidores/antagonistas se seleccionan de anticuerpos, oligonucleótidos, proteínas o moléculas pequeñas.

16. El método de acuerdo con las reivindicaciones 12-14, en el que la enfermedad es un tumor o una enfermedad

de los riñones, músculos, huesos y ojos.